【应用】采用Coriolis Compact实现快速无创的禽流感病毒扩散检

背景

随着源自goose/Guangdong (Gs/GD)系的 2.3.4.4b 支系在全球范围内的传播，高致病性禽流感病毒（HPAIV）已成为对家禽业和野生动物多样性构成严重威胁的重要病原体。这类病毒能够感染多种鸟类，因此极有可能促进其在全球野鸟群体间的广泛传播。研究显示，与鸡相比，鸭子感染该病毒所需的感染剂量和致死剂量更低，但临床症状却极轻微。由此，鸭类在病毒于养殖系统内以及不同养殖场之间的传播中扮演着关键角色。
感染的鸟类会将病毒排入环境中，病毒的传播可通过直接或间接接触（包括空气传播）发生，从而引发禽群内部及禽群之间的感染。此外，由于病毒可在环境中存活，环境采样有望成为禽流感监测的替代方案，取代对禽鸟的拭子采样。这种方法对禽鸟无创、效率更高，也不需要专业人员操作。因此，Filaire 团队开展了对感染 2.3.4.4b 支系 H5N8 高致病性禽流感病毒的鸭群的环境污染扩散研究。他们使用传统检测方法和空气监测方法（得益于 Coriolis Compact 生物气溶胶采样器），比较了两种采样手段的检测效果。

实验材料

Coriolis Compact（型号：P002055-CORC0-A.0），采样时间：20 分钟，流量：50 L/min
两株 2.3.4.4b 支goose/Guangdong (Gs/GD) H5N8 HPAIV 病毒
ID Gene Mag Fast Extraction Kit 磁珠核酸提取试剂盒（Innovative Diagnostics, Grabel, 法国）
KingFisher 96 自动磁珠提取仪（Thermo Fisher, 美国加州卡尔斯巴德）
Influenza H5/H7 Triplex Kit（Innovative Diagnostics, Grabel, 法国）

实验方案

两种病毒均通过向 9–11日龄特定病原体阴性（SPF）鸡胚的尿囊腔注射进行增殖与定量。随后，将鸭随机分为两个房间饲养，饲料与饮水自由摄取。经过一周适应期后，每个房间的 10 只鸭经鼻腔内接种 10⁵ EID₅₀ 的 H5N8/2017 或 H5N8/2020 株病毒。接种后一天，在每个房间中各引入 6 只未接种鸭，用以评估病毒接触传播能力。 为研究病毒排出情况，依据官方 HPAIV 检测协议收集口咽拭子（OP）和泄殖腔拭子（CL）。环境污染通过在鸭舍中布置 Coriolis Compact 生物气溶胶采样器进行监测。采集样品于 4 °C 保存最多两天后转移至 −80 °C 冻存。 拭子样品置于含 500 µL 磷酸盐缓冲液（PBS）的 1.5 mL 离心管中，涡旋混匀 10–15 秒；Coriolis Compact 收集的气溶胶样品以 1 mL PBS 重悬，并涡旋混匀 5–15 秒以释放收集管壁上的颗粒，必要时再进行移液操作。所有样品均在 IRTA-CReSA −80 °C 冻存，并于图卢兹国家兽医学院 BSL-3 实验室检测。 总 RNA 使用 ID Gene Mag Fast Extraction Kit 及 KingFisher 96 自动系统提取。H5 型 AIV RNA 检测采用 Influenza H5/H7 Triplex Kit，通过一步法实时定量反转录 PCR（rRT-qPCR）进行，共 40 个扩增循环。未检出病毒 RNA 的样品视为阴性。 该实验由法国图卢兹 IHAP 研究单元与西班牙巴塞罗那 CReSA-IRTA 联合开展，选用法国 2017 年和 2020 年暴发疫情中的两株 HPAIV，以比较其生物学特性差异。

实验设计时间线：比较传统官方 HPAIV 检测方法（拭子采样）与环境气溶胶采样（Coriolis Compact）在病毒 RNA 检测性能上的差异。

实验结果

结果显示：通过官方 HPAIV 检测方法（OP、CL 拭子）与 Coriolis Compact 环境空气采样所得的病毒 RNA 传播动态趋势一致。 图 2A、2B：两种病毒株在 OP 与 CL 拭子检测中的病毒 RNA 负载变化。红、蓝实线分别代表接种 H5N8/2017 和 H5N8/2020 的鸭群；红、蓝虚线代表接触组。 图 2C：两种病毒株在鸭舍环境空气中（Coriolis Compact 采样）的病毒 RNA 负载变化。 对于两种拭子采样方式，同一病毒株的接种鸭与接触鸭的病毒 RNA 含量随时间变化趋势相似（图 2A、2B）。病毒 RNA 负载在感染后约第 4 天（dpi）达到峰值，之后逐渐下降至第 14 天；无论通过 OP 拭子还是 Coriolis Compact 采样，均呈现这一规律（图 2）。 对于 CL 拭子检测，H5N8/2020 株在 2–6 dpi 间病毒 RNA 水平相对稳定，10–14 dpi 逐渐下降；而 H5N8/2017 株的变化模式更接近 OP 拭子与 Coriolis Compact 采样的趋势（图 2B）。尽管两种病毒株存在一定的生物学差异，但三种采样方法检测到的病毒排毒总体趋势一致（图 2）。

结论

Filaire 团队的研究表明，在感染或未感染 HPAIV 的鸭群圈舍中，病毒感染与扩散的模式在采用标准生物采样（拭子）或使用 Coriolis Compact 生物气溶胶采样器进行环境检测时基本一致。 Coriolis Compact 生物气溶胶采样器 提供了一种符合人体工学、可靠的替代方案，可替代成本更高且需专业人员操作的拭子采样。该方法具有快速、操作简便、无创、经济高效且准确等优势，为农场内禽流感病毒的主动检测与监测提供了理想手段，相较传统拭子检测更具实用价值。

来源：Filaire, F., Bertran, K., Gaide, N. et al. Viral shedding and environmental dispersion of two clade 2.3.4.4b H5 high pathogenicity avian influenza viruses in experimentally infected mule ducks: implications for environmental sampling. Vet Res 55, 100 (2024). https://doi.org/10.1186/s13567-024-01357-z